王占祥教授课题组发现CDK抑制剂AT7519抑制胶质母细胞瘤生长的机制

发布日期:2023-04-14     点击数:

 

近日,厦门大学附属第一医院神经外科及福建省神经系统肿瘤诊断与精准治疗王占祥教授团队在国际知名学术期刊《Cell Death & Disease》(中科院一区TOP期刊,影响因子9.685)上发表了题为The CDK inhibitor AT7519 inhibits human glioblastoma cell growth by inducing apoptosis, pyroptosis and cell cycle arrest的原创性基础研究论文。厦门大学医学院在读硕士赵文鹏为该论文的第一作者,厦门大学附属第一医院神经外科王占祥教授和张炳长助理研究员为该论文的共同通讯作者。

 

 

 

胶质母细胞瘤(GBM)是最致命的原发性中枢神经系统肿瘤之一。胶质母细胞瘤患者的一线治疗方案是以手术切除为主的综合治疗,包括术后放疗联合替莫唑胺(TMZ)辅助化疗。然而,目前GBM患者的预后不佳,中位生存期仍不到15个月。寻找治疗GBM的新药迫在眉睫。

本论文采用高通量药物筛选的方法,在临床期小分子药物库中发现CDK抑制剂AT7519GBM具有潜在的抗肿瘤活性。AT7519是第二代多靶点周期蛋白依赖性激酶抑制剂,可选择性抑制CDK1CDK2CDK4CDK6CDK9AT7519不但影响细胞周期的进程,而且抑制RNA聚合酶II下游的转录。AT7519在血液系统恶性肿瘤中表现出良好的安全性和强大的抗肿瘤活性,目前处于临床开发阶段。但是AT7519胶质母细胞瘤中的抗肿瘤机制目前还不清楚。

用去除血清饥饿的方法将细胞周期同步化之后,U251U87MG细胞单独用培养基和0.4 mMAT7519培养61224 hPI染色后流式仪分析细胞周期的具体比例,结果显示AT7519 处理U251U87MG细胞6h后,G1期和G2期细胞比例开始增加。当AT7519 处理U251U87MG细胞24h时,G1期细胞的比例显著增加。Western blot结果显示与细胞周期G1-S转化有关的p-RB,p-CDK2表达量显著下降, 与细胞周期G2-M转化有关的p-CDK1,cyclin B1表达量显著下降。综上所述,AT7519U87MGU251细胞阻滞在G1G2期。

 

 

 

U87MG, U251GBM 原代细胞AT7519处理后进行PI  Annexin-V -FITC 染色,流式细胞仪分析细胞凋亡情况结果显示在U87MGU251细胞中,AT7519以浓度依赖的方式显著增加凋亡细胞的比例。GBM60 细胞中对照组和AT7519处理组的凋亡细胞比例是12.03% VS 77.93% (p < 0.0001,非配对t检验),在GBM38 细胞中对照组和AT7519处理组的凋亡细胞比例是8.39% VS 69.73% (p < 0.0001,非配对t检验)Western blot结果显示随着AT7519浓度的升高,抗凋亡蛋白MCL-1BCL-2表达量在U87MGU251 细胞中显著下降,促凋亡蛋白NOXA和线粒体释放Cyt-c表达量显著升高。这些内源性凋亡信号分子的变化激活下游caspase-9, caspase-3 , and PARP1的活性, 出现cleaved caspase-9cleaved caspase-3cleaved PARP1这三种凋亡关键蛋白的表达增加。JC-1染色结果显示,AT7519可显著降低U251U87MG细胞的线粒体膜电位(p < 0.05,非配对t检验)。我们进一步在GBM原代细胞中检测凋亡关键蛋白表达情况。Western blot结果显示凋亡的标志性蛋白cleaved PARP1cleaved caspase-3AT7519处理组中显著增加。以上结果证明AT7519可以诱导GBM细胞凋亡。

 

 

倒置显微镜下观察AT7519处理48 h后的细胞形态,与对照组相比,在AT7519处理组中观察到U251U87MG细胞上有气泡样的突起。扫描电镜显示AT7519处理后的U251U87MG细胞膜上有多个小孔。此外,在LDH释放实验中,AT7519处理后的U87MGU251细胞LDH释放增多(p < 0.0001,非配对t检验),提示细胞膜的完整性受到了破坏。Western blot检测了gasdermin家族蛋白及其裂解蛋白,结果显示在U87MGU251细胞中,随着AT7519浓度的提高GSDME-N表达量逐渐升高。进一步我们在GBM原代细胞进行了验证,Western blot结果显示AT7519处理后焦亡的打孔蛋白GSDME-N表达增加。以上结果证明,AT7519诱导gasdermin E裂解产生打孔蛋白,进一步出现细胞肿胀破裂,导致GBM细胞焦亡。接下来先用Z-VAD-FMK预处理,然后用AT7519处理GBM细胞48 hWestern blot结果表明与单独使用AT7519对比,Z-VAD-FMKAT7519联合组中cleaved PARP1 and GSDME-N蛋白表达量显著下降。LDH释放实验结果显示,与单独使用AT7519对比,Z-VAD-FMKAT7519联合处理后U87MGU251细胞LDH释放量显著减少。进一步Western blot结果显示,caspase‐3特异性抑制剂(Z‐DEVD‐FMK)可以抑制GSDME-N的表达。以上结果证明AT7519通过caspase-3裂解gasdermin E诱导GBM细胞焦亡。

 

为了探究AT7519在体内是否有抗肿瘤的作用。我们用U87MG细胞建立GBM皮下异种移植模型,5天后以20mg/kg的剂量连续腹腔注射21天。期间定期测量裸鼠的体重和肿瘤的体积。7天后,AT7519治疗组的皮下肿瘤体积开始减小;到21天时AT7519治疗组的皮下肿瘤重量和体积均明显减小,并且小鼠体重没有明显的变化。在初步探究AT7519在体内的安全性和抗肿瘤作用后,我们又在GBM颅内异种移植裸鼠中验证AT7519的抗肿瘤活性。同样以20mg/kgAT7519连续腹腔注射AT7519 21天,脑组织冠状位切片后HE染色的结果显示AT7519治疗后颅内肿瘤相对面积减少约一半(p < 0.05,非配对t检验)Western blot检测细胞焦亡、凋亡和细胞周期相关关键蛋白,结果显示AT7519处理组中cleaved caspase-3, cleaved PARP1GSDME-N水平升高,而p-CDK1p-CDK2蛋白水平降低。免疫组化的结果显示,与对照组相比,AT7519治疗组肿瘤中的cleaved caspase-3cleaved PARP1表达增加,p-CDK1p-CDK2表达明显减少。以上结果证明AT7519在体内通过诱导凋亡、焦亡和细胞周期阻滞抑制胶质母细胞瘤生长。

 

 

 

综上所述,AT7519GBM细胞系、原代细胞和异种移植裸鼠中通过阻滞细胞周期进程、诱导细胞凋亡和焦亡的方式显著抑制肿瘤的生长。因此,AT7519是一种治疗GBM的潜在小分子靶向药物。

 

论文链接https://www.nature.com/articles/s41419-022-05528-8


通讯作者

 

王占祥,医学博士,主任医师,教授,博士生导师,中国医疗行业最高奖“中国医师奖”获得者,国务院特殊津贴专家。

从事临床医学研究与疾病救治工作近40年,曾留学日本,多次到美国哈佛大学,英国牛津大学等国际知名学术机构进行交流访问,先后获得福建省优秀归国人员,福建省突出贡献中青年专家,入选福建省新世纪百千万人才工程。他是厦门市重点引进留学归国人才,厦门市杰出科技人才,厦门市领军人才,首届厦门市医学学术与技术带头人,厦门市脑科中心学科带头人,2022年被评为厦门经济特区建设40周年创新创业人物,厦门市科学技术重大贡献奖获得者

现任厦门大学附属第一医院院长,新冠肺炎定点救治医院院长,国家神经系统疾病医学中心福建分中心主任,福建省脑科疾病临床医学研究中心主任,福建省神经系统肿瘤诊断与精准治疗重点实验室主任,厦门大学神经科学系主任。

王占祥是我国知名的神经外科专家和学科带头人,先后主持国家自然科学基金、国际交流课题、新冠应急攻关项目,以及福建省和厦门市医疗卫生重点项目等20余个项目。在 STTT, JCI, Nat Commun 等Top期刊发表论文 280 余篇(SCI 收录 80 篇),参编参译专著 12 部,参与临床救治指南和专家共识12项,获批实用新型专利 8 项,获军队、省、市级科技奖励11项。指导了福建省神经外科专业第一位博士后,目前已指导博士后 7 位,培养博、硕士研究生 63 人。

 

第一作者

 

张炳长,博士,神经外科助理研究员。作为项目负责人主持福建省自然科学基金项目1项,参与4项科学基金,包括自然科学基金项目1项,省市新冠应急攻关项目各1项。Signal Transduct Target Ther》、《Sci China Life Sci、《Cell Death and Disease》多个杂志发表SCI论文十余篇。

第一作者

 

 

赵文鹏2020级厦门大学医学院专业型外科学硕士研究生,师从全国知名神经外科专家王占祥教授,硕士期间主要从事胶质瘤新药的高通量筛选及抗肿瘤机制研究。目前发表SCI论文9篇(其中第一作者2篇),相关研究成果受邀在中华医学会神经外科分会第十九次全国年会大会汇报。2023年荣获厦门大学“柳玉滨青年科技奖学金”。

上一条:我院吴三纲团队获2022年度厦门市科技进步奖三等奖

下一条:厦门大学附属第一医院叶峰课题组与厦门大学药学院刘文教授团队合作揭示EP300/circRERE/miR-6837-3p/MAVS轴在结直肠癌抗肿瘤免疫调节中的作用和机制